Knox, İskoçya için hem dini hem siyasi bir figür olmuştur. Dönemin koşullarında din ve siyaset birbirinden kolayca ayrılabilen kavramlar değildiler. Hal böyle olunca dini fikirlerin gelişimi aynı zamanda siyasetin dolambaçlı yollarından geçmekteydi. Knox da fikirlerini Tanrı’nın Ruhu tarafından güçlendirilmiş bir biçimde vaaz eden birisiydi. Dolayısıyla, Avrupa’yı kasıp kavuran Protestan Reformu’nun, özellikle de Jean Calvin’in fikirlerinden etkilenen Knox, derin bir dini değişim geçirdi. Cenevre’de geçirdiği süre boyunca Protestan Reformu ideallerine tanık olması, Protestan ilkelerine olan bağlılığını pekiştirmiş ve İskoçya’da gelecekte üstleneceği rol için zemin hazırlamıştır.
Cenevre’den dönüşünde, Calvin’den edinmiş olduğu Protestan fikirleri vaaz etmeye karar verir ve bu da zaten sarsılmakta olan Roma Katolik otoritesinin zayıflatıldığına dair alarmlar çalınmasına sebep olur. Knox, insanların veya yetkililerin (görevleri her ne olursa olsun) düşüncelerini önemsemiyordu. Daha doğrusu, insanların ve yetkililerin görüşleri Kutsal Yazılara aykırıysa, Knox ucunda ölüm olsa bile Kutsal Yazıları vaaz etmeye devam ediyordu. Bu elbette Knox’un vurdumduymaz biri olduğu anlamına gelmez. Knox özellikle ruhsal konularda son derece donanımlı ve yazılarından da anlaşılacağı üzere birçok ruhsal denenmeyi, zorluğu, sevinci ve mutluluğu bizzat deneyimlemiş birisidir. Dolayısıyla, Knox’un vaazları kısa sürede büyük ilgi gördü ve Protestan Reformu’nun fikirlerine açık olan birçok İskoç arasında karşılık buldu. Knox’un karmaşık teolojik kavramları ikna edici bir şekilde ifade etme kabiliyeti, İskoçya’da Protestan hareketinin genişlemesine katkıda bulunarak giderek artan bir takipçi kitlesi çekti.
Hal böyle olunca John Knox, İskoçya’da reformcu ve Protestan bir kilisenin kurulmasında merkezi bir rol oynamıştır. Onun liderliği ve teolojik görüşleri, 1560 yılında First Book of Discipline‘in hazırlanmasına katkıda bulunmuştur. Bu belge, Presbiteryen bir yönetim sistemini ve Tanrı Sözü’ne odaklanmayı vurgulayarak yeni kilisenin yapısını ve ilkelerini özetliyordu. Bunun yanı sıra, Knox’un Katolik öğreti ve uygulamalarına yönelik açık sözlü eleştirileri Katolik yetkililerle çatışmasına yol açtı. Knox muhalefetle, zulümle ve zaman zaman da hapisle karşı karşıya kaldı. Bu zorluklara rağmen Knox, Protestanlık davasını ilerletme konusundaki kararlılığını yitirmedi. John Knox, İskoç Reformu boyunca ibadette sadeliği ve öğretisel saflığa odaklanmayı savunmuştur. O, Reform ilkeleriyle uyumlu olmayan Katolik uygulamaların ve ritüellerin kalıntıları olarak algıladığı şeyleri bertaraf etmeye çalışmıştır. Saflık ve sadeliğe yapılan bu vurgu, ortaya çıkan Protestan Kilisesi’nin karakterini şekillendirmiştir. Dönemin siyasi liderleriyle aktif bir şekilde tartışmalara ve etkileşimlere girdiği için Knox’un etkisi siyasi alana da yayıldı. Tartışma yaşadığı son derece önemli kişilerden biri de İngiltere Kraliçesi Mary idi. Buradaki tartışma, kimi tarihçiler tarafından büyük cesaret örneği olarak algılansa da kimileri tarafından ise Knox’un söylemiş olduğu sözleri söylemediğini iddia etmesiyle bazı konularda geri adım attığının bir örneğidir. Ancak her halükârda, her ne olursa olsun, Knox’un bir insan olması ve insani zayıflıklara ve hatalara bürünmüş olması, onu bir ilah yapmayı önlemektedir – ki bu da iyi bir şeydir. Knox, İskoçya’da Protestan bir hükümetin kurulmasını savunarak dini ve siyasi yaşamın birbirleriyle bağlantılı olduğuna dair duyduğu inancı ortaya koymuştur.
